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    超凈工作臺在纖維細胞生物學實驗的使用
    發布時間:2012-06-04 08:52:49   瀏覽:5114

    超凈工作臺在纖維細胞生物學實驗的使用

    近年來,隨著組織工程及再生醫學的迅猛進展脂肪干細胞鑒于其取卡材便利,來源豐富,低免疫性及多分化潛能等諸多優點,已成為人們研究的熱門。但以往的研究大多集中在ADSCs多分化潛能在組織工程和再生醫學中的應用,很少關照ADSCs分泌功能在組織損傷修復中的作用。本實驗通過使用超凈工作臺并觀測研究了ADSCs分泌功能對成纖維細胞的生物學影響,探討ADSCs分泌功能促創面愈合的機制。


    材料和方法

    1 主要儀器與試劑:DMEM培養液、胰酶、I型膠原酶、二甲基亞砜、MTT、小牛血清,胎牛血清,annexinV凋亡檢測試劑盒,Mondel680型酶標儀,垂直流超凈工作臺,CO2細胞培養箱,顛倒顯微鏡,流式細胞儀。

    2 ADSCs分離與培養:取腹部外科手術患者皮下脂肪組織約59,無菌條件下用剪刀剔除血管及其它組織碎片,用含雙抗的PBS液反復浸泡沖洗3次,每次約5min,用眼科剪將脂肪組織剪成約lmm3的碎塊,置于0.1%的I型膠原酶中于37℃水浴振蕩消化1h;加入等體積l0%胎牛血清精細消化后,用200目的細胞篩網過濾,600g離心lOmin,棄去上層脂肪及上清液,沉淀用含l0%胎牛血清培養液重懸接種于培養瓶,置于37℃、5%的C02培養箱中陳規培養。2天后換液,細胞長滿80%時傳代培養。

    3 3ADSCs培養上清液的制備:選擇生長良好第3代.ADSCs細胞接種于75cm2的培養瓶,生長至80%融合時,換成尢血清培養液DMEM15ml,培養3天后,搜集上清液。上清液經O.22μm的濾膜過濾.分裝,一80。C凍存備用。

    4 人皮膚成纖維細胞的培養:用組織塊法培養原代細胞,置于10%小牛血清培養液中,置于37℃、5%C02培養箱中陳規培養。

    5 成纖維細胞增殖的測定:采納MTT法測定。傳代時取第3代成纖維細胞以3×10/孔接種于12孔板,陳規培養24h后棄上清,設實驗組及對比組,實驗組均用ADSC-CM及2%小牛血清配制,對比組僅用2%小牛血清培養液,每組設3個復孔。各組加對應的培養液lml,連續培養3天后,每孔分別加入5g/L的MTT100μl,37℃、5%C02孵育4h后,精細培養:吸棄上清液,每孔加入750μl。二甲基亞楓,連續孵育lOmin后稍微振蕩使紫藍色沉淀融解,然后以150μl/孔移動至96孔板,每孔反復5次。用酶標儀測定490nm波長下的吸光度值。

     原文來源:http://www.judi36.com/

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